金达阳光

24小时客户服务热线:
010-59797112

蛋白质凝胶电泳凝胶的制备

金达阳光 • 2015/1/26 11:15:33 • 来源:51jinda.com • 点击:3224

【材料与试剂】

(1)30%的丙烯酰胺:分别称取29g 丙烯酰胺,1g N,N -亚甲双丙烯酰胺加温热的去离子水60ml,加热至37℃溶解,补加水至终体积为100ml,过滤,即配成30%(w/v)丙烯酰胺贮存溶液。丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸,这一脱氨基反应是光催化或碱催化,故溶液的pH值不超过7.0,应置于棕色瓶中4℃保存。

(2)10%十二烷基硫酸钠(SDS):称取10gSDS加去离子水90ml加热至68℃,加几滴浓盐酸调节至pH7.2加水至100ml,即为10%(w/v)SDS。

(3)浓缩胶缓冲液(1mol/L Tris-HCl pH 6.8):12.12g Tris溶解在80ml去离子水中,用浓盐酸调节pH至6.8,再加去离子水至100ml。4℃保存。

(4)分离胶缓冲液(1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8):18.16g Tris溶解在80ml去离子水中,用浓盐酸调节pH至8.8, 再加去离子水至100ml。4℃保存。

(5)10%过硫酸胺(AP):过硫酸胺提供催化丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基,可用去离子水配制小量10%(W/V)贮存液并4℃保存。由于过硫酸胺会缓慢分解,故应隔周新鲜配制。

(6)TEMED(N , N , N, N -四甲基乙二胺)TEMED通过催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合,由于TEMED只能以游离碱的形式发挥作用,因此pH值较低时聚合反应受到抑制。

(7)Tris-甘氨酸电泳缓冲液:分别称取15.1g Tris 和94g甘氨酸,溶解在900 ml去离子水中,然后加入50 ml 10%(w/v)SDS,再加去离子水至1000 ml则成5?贮存液。使用时稀释5倍,终浓度Tris为25mmol/L、甘氨酸为250mmol/L、0.1%SDS,缓冲液pH为(8.3)。

(8)聚丙烯酰胺凝胶电泳槽和电泳仪

(9)加样器和吸头等

【操作方法】

(1) 根据垂直电泳槽说明书安装玻璃板,确定需配制分离胶的浓度和体积,按“配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液”所列成分(见书末附录)配制所需分离胶;

(2) 迅速将分离胶注入两玻璃板间隙中,留出灌注积层胶所需空间(梳子的齿长再加1cm,用滴管小心地在分离胶上覆盖一层0.1% SDS(当丙烯酰胺浓度≤8%时)或异丁醇或水(当丙烯酰胺浓度≥10%时),覆盖层可防止氧扩散进入凝胶而抑制聚合反应。将凝胶垂直置于室温下;

(3) 分离胶聚合完全后,倒出覆盖层液体,用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺,尽可能排除凝胶上的液体;

(4) 确定需配制浓缩胶的体积,按“配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶所用溶液”(见书末附录)配制所需浓缩胶,然后直接将浓缩胶灌注在分离胶上,立即插入干净的配套梳子,避免气泡,然后加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙。待浓缩胶聚合后,拔出梳子,形成加样孔;

(5) 用去离子水将Tris-甘氨酸电泳缓冲液贮存液稀释5倍,倒入电泳槽,将加样孔充满,这时加样孔中的气泡可通过电泳缓冲液排除。

代理品牌

品牌目录

请联系我们

地址:北京市昌平区天通苑东一区6号楼5门二层

电话:010-57790662 59797112

传真:010-81778195

邮箱:info@51jinda.com

微信关注 扫一扫